Аміноацил-тРНК синтетаза є одним із основних ферментів білкового синтезу. Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) ссавців складається із двох структурних одиниць, N-кінцевого каталітичного (міні TyrRS) та С-кінцевого цитокіноподібного модулів. У повнорозмірній TyrRS N-кінцевий модуль здійснює каталітичну функцію зв"язування амінокислоти із тРНК, тоді як С-модуль корегує та стабілізує розміщення тРНК в активному центрі фермента. Після розщеп- лення тирозил-тРНК синтетази еластазою на міні TyrRS та С-модуль, останні виявляють цитокінові властивості. Метою роботи була оптимізація експресії клонованої у плазміді pET30а-39KYRS кДНК міні TyrRS Bos taurus, в якій за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу кодони триптофана в положенні 87 та 283 замінені на кодони аланіна, та отримання мутантного однотриптофанового білка міні BtTyrRS для подальшого дослідження за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії конформаційних змін фермента на стадії утворення тирозиладенілату та при взає- модії з акцепторним кінцем тРНКTyr, а також визначення впливу залишків триптофану в положенні 87 та 283 в його структурі на структурно-динамічні й функціональні властивості ензиму. Установлено, що заміна двох кодонів амінокислоти триптофана на кодони амінокислоти аланіна в кДНК мін&і BtTyrRS, клонованої в експресуючій плазміді pET30а- 39KYRSW40, не впливає на синтез і розчинність мутантної форми ферменту в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE. Кіль- кість розчинної форми рекомбінантної мутантної міні BtTyrRS у цитоплазмі бактеріальних &клітин при експресії в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE значно підвищується при інкубації бактеріальної культури за температури 25о С порів- няно з температурою інкубації при 37 о С. Вихід отриманого очищеного білка мутантної міні BtTyrRS становить у сер&едньому 2,5 мг із 100 мл культурального середовища, що є достатнім для проведення подальших структурнофункціональних досліджень мутантної форми ферменту. Методом флуоресцентної спектроскопії показано компактну структуру рекомбінантного білка.
Амин&оацил-тРНК синтетаза является одним из основных ферментов белкового синтеза. Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) мле- копитающих состоит из двух структурных единиц, N-концевого каталитического (мини TyrRS) и С-концевого цитокиноподобного модулей. В полнор&азмерной TyrRS N-концевой модуль осуществляет каталитическую функцию связывания аминокислоты с тРНК, тогда как С-модуль корректирует и стабилизирует размещения тРНК в активном центре фермента. После расщепления тирозил- тРНК синтетазы эластазой на ми&ни TyrRS и С-модуль, последние проявляют цитокиновые свойства. Целью работы была оптимизация экспрессии клонированной в плазмиде pET30а-39KYRS кДНК мини TyrRS Bos taurus, в которой с помощью сайт-направленного мутагенеза кодона триптофана в положении& 87 и 283 заменены на кодоны аланина и получение мутан- тного однотриптофанового белка мини BtTyrRS для дальнейшего исследования с помощью методов флуоресцентной спектроскопии конформационных изменений фермента на стадии образования тирозиладенилата &и при взаимодействии с акцепторным концом тРНКTyr, а также определение влияния остатков триптофана в положении 87 и 283 в его структуре на структурно-динамические и функциональные свойства фермента. Установлено, что замена двух кодонов триптофана на &кодоны аланина в кДНК мини TyrRS, клонированной в экспрессирующей плазмиде pET30а-39KYRSW40, не влияет на синтез и растворимость мутантной формы фермента в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysE. Количество растворимой формы рекомбинантной мутантной мини Bt&TyrRS в цитоплазме бактериальных клеток при экспрессии в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysE значительно повышается при инкубации бактериальной культуры при температуре 25о С по сравне- нию с температурой инкубации при 37о С. Выход полученного очищенного& белка мутантной мини BtTyrRS составляет в среднем 2,5 мг с 100 мл культуральной среды, что является достаточным для проведения дальнейших структурно-функциональных исследований му- тантной формы фермента. Методом флуоресцентной спектроскопии показан&
